Ha estat el primer dia de les jornades. En arribar al PCB (Parc Científic de Barcelona), m'he trobat amb el meu tutor, l'Albert Garcia, i hem pujat al seu laboratori. Un cop a dalt, hem tornat a parlar de l'estudi que farem, i de la part que tocava fer avui. M'ha explicat el funcionament d'alguns dels materials que utilitzaríem, com és el cas de la placa multivell i hem començat a dur a terme el protocol per a fer el primer estudi.
Objectius
- Sembrar una placa multiwell per al posterior estudi de repoblació cel·lular.
Materials
MATERIALS FÍSICS
|
REACTIUS
|
|
|
Procediment
Després de tenir tots els materials i els reactius, cal tenir en compte que hem de treballar en condicions estèrils per això treballarem en una Cabina de cultiu de classe. Seguim el protocol per a poder dur a terme els experiments. Aquest consisteix en:
- Activar de 5 a 10 minuts els rajos ultravioleta (UV) de la cabina per esterilitzar-la.
- Una vegada esterilitzat, introduir tots els materials que utilitzarem, a dins, prèviament ruixats amb etanol, per tal d’assegurar-nos que estan desinfectats.
- Per acabar amb aquesta part, es posen els reactius al bany a 37 ºC aproximadament, per tal de descongelar la tripsina i escalfar el medi de manera que al introduir les cèl·lules, es trobi en el rang fisiològic.
- Tripsinització: Per començar es retira el medi del flasc on es troben les cèl·lules en creixement. Aquest flascó es manté en un incuadora a 37 ºC i a 5% CO2. S’introdueix 2 ml de tripsina. La tripsina és un enzim que trenca els enllaços de les proteïnes mitjançant la hidròlisi per a formar pèptids de menor mida i aminoàcids. Aquesta s’introdueix per eliminar les restes de medi o les cèl·lules mortes, ja que aquestes no ens interessen perquè inhibeixen la funció de la tripsina; i tot seguit es retira. D’aquest procés se'n diu rentat.
 |  |
Incubadora on es troben les cèl·lules, a una temperatura d 37,1 ٥C
|
Interior de la incubadora amb cultius de cèl·lules.
|
Després, es torna a introduir tripsina, amb menys quantitat (1 ml) i deixem 10 min a una temperatura de 37 ºC. La tripsina trenca les adhesions de les cèl·lules amb el flascó i entre elles. Això ens permet recuperar tot el contingut cel·lular.
Un cop han passat els 10 minuts, comprovem que les cèl·lules estiguin desenganxades amb el microscopi. Per bloquejar l’efecte de la tripsina, s’afegeixen 9 ml de medi (que conté FBS amb la proteïna i bloqueja l’efecte de la tripsina). Es retira tot el contingut del flasc i s’introdueix en un falcon de 50 ml. Una vegada dins, es col·loca a la centrifugadora on es deixa centrifugant durant 5 minuts a 1200 rpm. L’objectiu és eliminar les restes de tripsina del falcon. Tot seguit es retira el sobrenedant, anant en compte de que no es tregui el pellet de cèl·lules que hi havia al fons del falcon. Seguidament es resuspen amb 5 ml de medi.
Un cop han passat els 10 minuts, comprovem que les cèl·lules estiguin desenganxades amb el microscopi. Per bloquejar l’efecte de la tripsina, s’afegeixen 9 ml de medi (que conté FBS amb la proteïna i bloqueja l’efecte de la tripsina). Es retira tot el contingut del flasc i s’introdueix en un falcon de 50 ml. Una vegada dins, es col·loca a la centrifugadora on es deixa centrifugant durant 5 minuts a 1200 rpm. L’objectiu és eliminar les restes de tripsina del falcon. Tot seguit es retira el sobrenedant, anant en compte de que no es tregui el pellet de cèl·lules que hi havia al fons del falcon. Seguidament es resuspen amb 5 ml de medi.
- Recompte: tenint en compte que és important la densitat cel·lular en la que sembrem les cèl·lules, es necessita saber quin és el valor en la nostra solució en cèl·lules. Per això s’utilitza la cambra de Neubauer (per a més informació, veure Annex). Obtenint un valor de 131·10^4 cèl·lules / mL.
2,5·10^4 cells / cm² x 2 cm² / pouet x 9 pouets totals x ml solució cèl·lular 131· 10^4 =
= 0,342 ml = 342 μL de solució cel·lular
= 0,342 ml = 342 μL de solució cel·lular
500μL / pouet x 9 pouets total= 4500 μL totals de medi de cèl·lules
4500 μL - 342 μL solució cel·lular → 4158 μL medi
Dins de la cabina de cultius (fig. 28) es pren 4158 μL de medi i els es posa en un falcon de 15 μL i després s’afegeix els 342 μL de la solució cel·lular diluïda.
 |
En aquesta imatge veiem:
a) A la dreta el falcon que conté la dilució.
b) A l’esquerra veiem la placa de cultiu de 24 pouets o la placa de multiwell.
c) Al darrere veiem el pipetejador i la capsa amb les puntes estèrils.
|
 |
En aquesta foto, es pot veure com estic introduint dins de la placa multiwell la dilució.
|
Es va comprovar que hagin cèl·lules a cada pouet mitjançant el microscopi. Finalment es col·loca a la incubadora on es mantenen a 37 ºC perquè s’expandeixin i formin una monocapa.
